如何正確進(jìn)行ELISA試劑盒檢測？

　　規(guī)格：96T 48T

　　用途：科研實驗(僅供實驗室研究使用)

　　保存：2-8℃。

　　有效期：6個月

　　結(jié)合物的制備

　　1. 戊二quan交聯(lián)法

　　戊二quan是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二quan直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。

　　ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡便、有效和重復(fù)性好等優(yōu)點。缺點是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，酶與抗體交聯(lián)時分子間的比例不嚴(yán)格，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊二quan作用，透析除去多余的戊二quan后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先將抗體與戊二quan作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。

　　2. 過碘suan鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時，過碘鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié)，其佳比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認(rèn)為是HRP可取的標(biāo)記方法，但也有人認(rèn)為所有試劑較為強烈，各批實驗結(jié)果不易重演。

　　按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中后的酶活性測定，因經(jīng)過洗滌，游離酶可被除去，并不影響終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法為簡便，但效果并不理想，因為此法只能去除留在上清中的游離酶，但相當(dāng)數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得佳的分離效果，但費用較貴。

　　結(jié)合物制得后，在用作ELISA試劑尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛取Ｊ褂眠^濃的結(jié)合物，既不經(jīng)濟(jì)，又可使本底增高;結(jié)合物的濃度過低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結(jié)合物的濃度予以選擇。適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時，能維護(hù)一個低的本底，并獲得測定的佳靈敏度，達(dá)到合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。就酶標(biāo)抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗時，能得到陽性反應(yīng)的高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時，將發(fā)生陽性反應(yīng)。但在用于具體的ELISA檢測中，酶標(biāo)抗體的適工作濃度受到固相載體的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度以及整個檢測系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫度和時間等的影響，因此必須在實際測定條件下進(jìn)行"滴配"選擇能達(dá)到高敏感度的大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。

　　結(jié)合物的保存

　　酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經(jīng)復(fù)溶，頗為不便。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時間保存。早期的ELISA試劑盒中的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng)，配以稀釋液(見3.2.5)臨用時按標(biāo)明的稀釋度稀釋成工作液?，F(xiàn)在較先進(jìn)的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保存期可達(dá)6個月。由于蛋白質(zhì)濃度較低，結(jié)合物易失活，需加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素(例如慶大霉素)和防腐劑(HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉)，以防止細(xì)菌生長。

　　結(jié)合物的稀釋液

　　用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)(例如1%牛血清白蛋白)，通過競爭以抑制結(jié)合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時，血清標(biāo)本需稀釋后進(jìn)行測定，也可應(yīng)用這種稀釋液。

　　BUNSEN本生 試劑盒組成

　　標(biāo)本要求

　　1. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

　　2. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

　　操作步驟

　　1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

　　2. 加樣

　　分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl(樣品終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

　　3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

　　4. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用

　　5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

　　6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

　　7. 溫育：操作同3。

　　8. 洗滌：操作同5。

　　9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

　　10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

　　11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

　　試劑盒實驗操作程序總結(jié)：

　　計算

　　以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

　　試劑盒實驗注意事項

　　1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

　　2. 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

　　3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

　　4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值)，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定，計算時請后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。

　　5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

　　6. 底物請避光保存。

　　7. 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

　　8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

　　9. 本試劑不同批號組分不得混用。

　　洗滌液

　　在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。

　　酶反應(yīng)終止液

　　常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

　　陽性對照品和陰性對照品

　　陽性對照品和陰性對照品是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測定，對照品好也為人血清，因為正常人血清在各種ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國外試劑盒中的對照品多以復(fù)鈣人血漿為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量好在試劑說明書中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可對標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個粗略的估計。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。

　　包被用抗體

　　包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。如免疫用抗原中含有雜質(zhì)(即便是微量的)，在抗血清中將出現(xiàn)雜抗體，必須除去(可用吸收法)后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性?？寡宀荒苤苯佑糜诎?，應(yīng)先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質(zhì)不穩(wěn)定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性，則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適當(dāng)稀釋后直接包被，必要時也可用純化的IgG。應(yīng)用單抗包被時應(yīng)注意，一種單抗僅針對一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。

　　包被的條件

　　包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗的特點和材料的性質(zhì)而選定。抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。

　　包被的方式

　　將抗原或抗體固定在過程稱為包被。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程。蛋白質(zhì)與聚苯乙xi固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。 IgG對聚苯乙xi等固相具有較強的吸附力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當(dāng)抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對該抗原的特異抗體作預(yù)包被，其后通過抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。此間接結(jié)合在固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法，試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙xi載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體時，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合?？蓪⒕郾揭襵i板先經(jīng)紫外線照射，以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合力。也可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。

　　脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面?？剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。

　　洗板方法：

　　1. 手工洗板方法：吸去或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。

　　2. 自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。待檢樣本：體液、血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液、組織勻漿、心房水標(biāo)本等，本生 既能滿足研發(fā)類客戶對產(chǎn)品種類、包裝的特殊要求，也能滿足生產(chǎn)型企業(yè)從小試、中試到規(guī)?；a(chǎn)各個階段的綜合需求。產(chǎn)品涵蓋有熒光定量PCR耗材(八聯(lián)管,單管,96孔板,384孔板,封板膜,輔助器等)，ELISA試劑盒，移液器吸嘴，離心管，凍存管，培養(yǎng)皿，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，吸頭，儀器及手套，培養(yǎng)基，抗體，血清，色譜耗材，針頭過濾器及實驗室常用耗材。

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