細(xì)胞凍存的過(guò)程中的注意事項(xiàng)

　　細(xì)胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過(guò)程中，在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準(zhǔn)備工作方面都需大量的耗費(fèi)，而且細(xì)胞一旦離開(kāi)活體開(kāi)始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要。細(xì)胞冷凍儲(chǔ)存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)-196℃，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無(wú)限的。下面BUNSEN本生詳述：

　　以下是關(guān)于細(xì)胞凍存的注意事項(xiàng)：

　　1. 為保持細(xì)胞最大存活率，一般都采用慢凍存融的方法。

　　2. 凍存物距液氮面越近溫度越低。標(biāo)準(zhǔn)的低凍速度為-1℃~12℃/分鐘，當(dāng)溫度下降達(dá)-25℃時(shí)，下降速度可增至-5~-10℃/分鐘，到-100℃時(shí)則可迅速凍入液氮中。因此要適當(dāng)掌握凍存物下降入液氮中的速度，過(guò)快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出，太慢則促冰晶形成。

　　3. 初次凍存者在下降凍存時(shí)，宜先用細(xì)木棒伸入罐中探測(cè)液面位置，然后需用溫度計(jì)與凍存物并行的辦法，以觀測(cè)下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關(guān)系，當(dāng)已掌握以上各參數(shù)和凍存技術(shù)熟練后，僅按下降時(shí)間和下降距離便可獲理想凍存效果。

　　4. 各種細(xì)胞對(duì)凍存速度的要求也不一樣;上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞耐受性可能大些，骨髓干細(xì)胞-2~-3℃/分鐘合適;胚胎細(xì)胞耐受性較小，不宜太快。總之在一開(kāi)始時(shí)，下降速度不能超過(guò)-10℃/分鐘。

　　5. 用什么防護(hù)劑合適和用量多大，要依細(xì)胞而定，初代培養(yǎng)細(xì)胞用DMSO 較好，一般細(xì)胞可用甘油;用量以較小為好。有人認(rèn)為人皮膚上皮細(xì)胞貯存在20%-30%甘油中很好。

　　6. 原則上細(xì)胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見(jiàn)，凍存一年后，應(yīng)再?gòu)?fù)蘇培養(yǎng)一次，然后再繼續(xù)凍存。

　　7. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷

　　8. 注意自身的安全，對(duì)于來(lái)自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等。

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