ELISA 實(shí)驗(yàn)的一些原理總結(jié)

　　ELISA  即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，是一類(lèi)常用的免疫酶技術(shù)。主要方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，然后利用酶標(biāo)記(偶聯(lián))的抗體或抗原與之孵育，加入顯色劑顯色，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定待測(cè)物顏色與標(biāo)準(zhǔn)物顏色的差異，繪制出酶活曲線(xiàn)得出待測(cè)物濃度。

　　ELISA 可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。ELISA 實(shí)驗(yàn)中有三種必要的試劑：

　?、?固相的抗原或抗體(用于結(jié)合到固相載體上)

　?、?標(biāo)記的抗原或抗體(標(biāo)記物)

　?、?作用的底物(顯色劑，用于顯色)

　　四種常見(jiàn) ELISA方法

　　1. 直接 ELISA

　　將抗原固定于 ELISA 板上，然后用酶標(biāo)抗體直檢測(cè)抗原。

　　相較于其它類(lèi)型的 ELISA 實(shí)驗(yàn)，直接 ELISA 實(shí)驗(yàn)步驟少，檢測(cè)速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反應(yīng)，測(cè)定結(jié)果不容易出錯(cuò)。但是由于直接  ELISA 的抗原不是特異性固定的，樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會(huì)與 ELISA 板結(jié)合，實(shí)驗(yàn)背景會(huì)比較高。而且直接 ELISA  每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗，實(shí)驗(yàn)不太靈活。另外由于沒(méi)有使用二抗，信號(hào)沒(méi)有被放大，降低了測(cè)定的靈敏度。

　　2. 間接 ELISA

　　先將抗原結(jié)合到 ELISA 板上，隨后分兩步進(jìn)行檢測(cè)：首先加入檢測(cè)抗體與抗原特異性結(jié)合，隨后加入酶標(biāo)二抗檢測(cè)并利用底物顯色。

　　與直接 ELISA 相比，間接 ELISA 用到酶標(biāo)二抗，具有更高的靈敏度，也需要更少的標(biāo)記抗體，更經(jīng)濟(jì)。間接 ELISA  還提供了更大的靈活性，因?yàn)椴煌囊豢鼓軌蚺c單一標(biāo)記的二抗一同使用。間接 ELISA  實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)是存在交叉反應(yīng)的可能性(酶標(biāo)二抗直接與抗原結(jié)合)，可能會(huì)增加背景，同時(shí)與直接 ELISA 相比，間接 ELISA  實(shí)驗(yàn)多了二抗孵育的步驟，實(shí)驗(yàn)周期延長(zhǎng)。

　　3. 夾心 ELISA

　　先將捕獲抗體固定于 ELISA 板孔中，然后加入樣品，接著加入檢測(cè)抗體。如果檢測(cè)抗體是酶標(biāo)抗體，則可稱(chēng)為直接夾心  ELISA;如果檢測(cè)抗體不帶有標(biāo)記，則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測(cè)抗體結(jié)合，這種稱(chēng)為間接夾心 ELISA。

　　夾心 ELISA 的靈敏度高，它比直接或間接 ELISA 敏感 2-5 倍;同時(shí)夾心 ELISA  使用兩種特異性抗體與抗原結(jié)合，擁有很高的特異性。另外夾心 ELISA 能夠通過(guò)直接或間接的方式進(jìn)行檢測(cè)，靈活性較高。夾心 ELISA  的缺點(diǎn)是對(duì)配對(duì)抗體要求很高，如果沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒或者已經(jīng)通過(guò)測(cè)試的配對(duì)抗體，則需要進(jìn)行配對(duì)抗體定制并進(jìn)行優(yōu)化，因?yàn)榻档筒东@抗體與檢測(cè)抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的。

　　4. 競(jìng)爭(zhēng) ELISA 法

　　預(yù)先將抗原包被在固相載體上，并加入酶標(biāo)記的特異性抗體。實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入待檢抗原(或抗體)，如果待檢物是抗原，則待檢抗原與預(yù)先包被在固相載體上的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)抗體;如果待檢測(cè)物是抗體，則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被在固相載體上的抗原。通過(guò)洗滌洗掉被競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的酶標(biāo)抗體，加底物顯色。需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原(或抗體)的量成反比。

　　競(jìng)爭(zhēng) ELISA 相對(duì)以上介紹的三種方法更復(fù)雜一些，但以上三種 ELISA 類(lèi)型都適用于競(jìng)爭(zhēng) ELISA  的形式。其主要優(yōu)點(diǎn)在于可檢測(cè)不純的樣品，且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高，但存在整體敏感性和專(zhuān)一性較差的問(wèn)題。

　　ELISA 常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法

　　1. 陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果

　?、?樣品、試劑被污染，或加樣時(shí)操作不當(dāng)導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑，小心操作。

　?、?酶標(biāo)板洗滌不——洗板前先將抗體溶液倒干凈，然后清洗液倒?jié)M板孔，確保能充分洗滌。

　　③ 抗體量過(guò)多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說(shuō)明書(shū)的推薦量使用抗體，稀釋抗體到適當(dāng)濃度。

　　2.酶標(biāo)板整體背景高

　?、?抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進(jìn)行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合。

　?、?底物結(jié)合濃度過(guò)高——對(duì)底物進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

　?、?反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)——當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀數(shù)時(shí)立即使用終止液終止反應(yīng)，適當(dāng)縮短顯色時(shí)間。

　　④ 底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的，若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染，應(yīng)更換新的底物溶液。

　?、?底物孵育過(guò)程沒(méi)有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。

　　3. 復(fù)孔之間重復(fù)性差

　?、?樣品數(shù)量不整齊，加樣時(shí)間有長(zhǎng)有短——加重復(fù)孔時(shí)盡量保持加樣時(shí)間與接近。

　?、?加樣量不一致——樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，并且使用同一移液槍。

　?、?洗滌條件、操作人員不一致——重復(fù)測(cè)定樣品時(shí)，操作條件、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致。

　　4. 吸光值偏高或偏低

　?、?樣品中待測(cè)抗原含量太低會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低——可嘗試增加樣品使用量。

　?、?加入抗體量不合適會(huì)造成結(jié)果偏低或偏高——使用建議抗體量或?yàn)榱耸菇Y(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的用量。

　　③ 孵育時(shí)間太短導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低——適當(dāng)延長(zhǎng)抗體或抗原的孵育時(shí)間，確保待測(cè)樣品與檢測(cè)抗體能充分結(jié)合。

　?、?孵育溫度不適合——應(yīng)抗體在最適宜條件下進(jìn)行孵育(一般 37℃ 孵育 1h )。

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